微生物在使用和傳代過程中容易發(fā)生污染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退，并有可能使優(yōu)良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。菌種存放的方法有哪些呢?

      傳代保存

　　有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉接、培養(yǎng)后再保存，它是MAX基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。

　　傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于MAX適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。

　　一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用恒溫培養(yǎng)箱37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

　　傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經常容易發(fā)霉;②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;③反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉種，工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。

      液體石蠟覆蓋保存法

　　該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優(yōu)點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。

      懸液保存法

　　即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的有：

　　① 蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發(fā)。

　　② 糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。

      載體保存法

　　將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種：

      ①土壤保存法

　　主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。

　　使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤MAX大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存。

      ②砂土保存法

　　取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經干熱滅菌后，加入1ml菌種培養(yǎng)液，經充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保存。

      ③硅膠保存法

　　以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

      ④磁珠保存法

　　將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經干熱滅菌后，接入菌懸液，MAX后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

      ⑤麩皮保存法

　　在麩皮內加入60%的水，經滅菌后接種培養(yǎng)，MAX后干燥保藏。

      ⑥紙片(濾紙)保存法

　　將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內進行保存。

       寄主保存法

　　微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

       冷凍保存法

　　適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點：

　　① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞;

　　② 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異;

　　③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長;

　　④ 建議在菌液內不添加電解質(如食鹽等);

　　⑤ 可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

　　⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。

　　⑦ 就動物細胞而言，應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度;而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍;

　　⑧ 若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好;

　　⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

      常用的冷凍保存法

　　① 低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。

　　② 干冰保存法(-70℃左右)：即將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進行冷凍保存。

　　③ 液氮保存法(-196℃)：是適用范圍MAX廣的微生物保存法。其操作步驟如下：

　　a.裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

　　b.熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時，則不需熔封。

　　c.檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。

　　d.緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

　　e.速冷：MAX后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

      冷凍干燥保存法

　　它的原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分。從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍干燥時，需注意以下幾個問題：

　　a.冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/ml。

　　b.菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

　　c.安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，恒溫培養(yǎng)箱60℃恒溫干燥。

　　d.添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

       Bordelli氏法

　　取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然后轉動小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH)，管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。